基于UHPLCQTOFMSMS和TC
慢性肾炎属于炎性、免疫性疾病，具有起病形式多样化、病理类型复杂、病情进展缓慢及病程迁延难愈等特点。临床常用类固醇疗法治疗，但该法极有可能导致类固醇依赖[1]。中医学者将慢性肾炎纳入中医学“肾风”“尿浊”“水肿”“肾消”“肾劳”等范畴，在饮食不节、七情内扰、劳累过度、外邪侵袭等内外因共同作用下，导致气阴两虚伴血瘀兼湿热。气虚不能化生津液，阴虚则津液不足，气阴两虚而虚象亦重，久病难愈而耗伤气阴，因而导致或加重气阴两虚证[2]。气阴两虚则致湿热、瘀血、浊毒积聚阻于肾经，进一步加重肾脏的负担，从而导致肾小球及肾小管不同程度的损伤和萎缩，目前以补益脾肾、利水渗湿、滋阴清热、活血化瘀为主要治则[3]。牡丹皮是毛茛科芍药属植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，味苦、辛，性微寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，用于热入营血、温毒发斑、吐血衄血、夜热早凉、无汗骨蒸、经闭痛经、跌扑伤痛、痈肿疮毒[4]。牡丹皮是中医临床上治疗慢性肾炎的常用药[5]。临床常用于治疗慢性肾炎的复方有六味地黄丸、牡丹散、萆薢散等，这些复方都含有牡丹皮，起到清热凉血、活血化瘀的作用，可治疗慢性肾炎病程中湿热、血瘀等证。而关于其治疗慢性肾炎的药效物质基础及其多成分、多靶点、多途径的网络调节机制尚未见报道。因此，本研究利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-highperformanceliquidchromatography-quadrupoletimeofflightmassspectrometry，UHPLC-QTOF-MS/MS）明确牡丹皮的成分组成，并基于中医药整合药理学研究平台（ChineseMedicineIntegratedPharmacologyResearchPlatform，TCMIP）对牡丹皮治疗慢性肾炎的主要药效成分和作用机制进行分析，识别其可能的药效成分群及作用靶点、通路，旨在为进一步深入研究牡丹皮治疗慢性肾炎的机制和临床用药提供科学依据。
1材料与方法
1.1仪器
超高效液相色谱仪（UPLC-H-Class）、四极杆飞行时间质谱仪（XevoG2-SQTOF），美国Waters公司；JP-C型高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；CPAD型电子天平，德国赛多利斯公司。
1.2试药
牡丹皮饮片（批号）购自山东鲁南制药股份有限公司提供，由中国中医科学院中药研究所何希荣主管药师鉴定为牡丹P.suffruticosaAndr.的干燥根皮（符合《中国药典》年版的相关要求）。对照品没食子酸（批号）、芍药苷（批号）、丹皮酚（批号）购自成都曼思特生物科技有限公司，质量分数均≥98%；质谱级甲醇、乙腈、甲酸，FisherScientific公司；蒸馏水，深圳屈臣氏蒸馏水有限公司
1.3化学成分确定
1.3.1供试品溶液的制备精密称取牡丹皮饮片粉碎（过4号筛），取粉末1.0g，精密称定，置于5mL量瓶中，加入70%甲醇溶液至刻度，摇匀，超声处理40min（功率W、频率40kHz），离心（r/min）10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
1.3.2混合对照品溶液的制备
分别取没食子酸、芍药苷、丹皮酚约2mg，精密称定，分别置于2mL量瓶中，加70%甲醇分别制成1.、1.、0.mg/mL的母液。分别精密量取以上母液各0.2mL至2mL量瓶中，加70%甲醇稀释并定容至刻度，即得混合对照品溶液。
1.3.3色谱条件色谱柱为WatersUHPLCHSST3（mm×2.1mm，1.8μm）；流动相为0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序：0～4min，2.0%～5.0%B；4～6min，5.0%～6.5%B；6～9min，6.5%～10.0%B；9～13min，10.0%～13.0%B；13～20min，13.0%～20.0%B；20～21min，20.0%～24.0%B；21～26min，24.0%～28.0%B；26～26.5min，28.0%～31.0%B；26.5～31min，31.0%～36.0%B；31～33min，36.0%～60.0%B；33～33.5min，60.0%～98.0%B。体积流量0.5mL/min，进样量为2.0μL，柱温40℃。
1.3.4质谱条件质谱分析采用了四极杆飞行时间质谱，XevoG2-SQTOFESI离子源，电离方式为正负离子模式（ESI?和ESI+），正离子毛细管电压0.5kV，负离子毛细管电压2.5kV，样品锥孔电压40V，离子源温度℃，脱溶剂温度为℃，雾化气温度℃，锥孔气体积流量为50L/Hr，溶媒挥散体积流量为L/Hr，质量扫描范围m/z50～1。碰撞能量正离子模式下低碰撞能量为40eV，高碰撞能量为60eV；负离子模式下低碰撞能量为60eV，高碰撞能量为80eV。液质系统由Masslynx4.1软件控制，并进行数据采集和图谱处理。
1.3.5数据分析通过WatersUNIFI数据处理软件对Continuum模式采集到的准分子离子峰信息进行分析，将原始质谱数据导入UNIFI软件中，选择误差为?5×10?6～5×10?6的分子式与ETCM数据库中牡丹皮化合物信息匹配，对化合物进行初步鉴定，选择目标化合物的二级碎片离子信息，与现有文献报道提供的保留时间、裂解规律等信息进行比对，进一步确认化合物的成分及结构。将汇总结果在MassLynxV4.1软件中通过提取离子及文献信息的方法人工鉴定并进行成分归属。
1.4候选靶标的收集
1.4.1化合物靶点的预测分析基于鉴定所得的牡丹皮成分，通过查找数据库（PubChem、Chemspider）或运用ChemDraw软件下载或绘制结构式[结构式保存成UNIFI软件匹配格式的摩文件（mol格式）]，建立牡丹皮成分库。
TCMIPv2.0平台的靶标预测是运用未知药物与已知药物化学结构相似原理，使用OpenBabel软件进行成分化学指纹特征的提取，并采用Tanimoto系数定义的相似度计算方法进行相似性打分，其中Tanimotoscore≥0.8则相似性强。在“中药靶标预测”界面中，导入牡丹皮化学成分的mol文件，为提高靶标预测的可靠性，选取相似性分数≥0.8的靶标作为候选靶标，导出去重获得牡丹皮的候选靶标群。
1.4.2疾病候选靶标的收集基于TCMIPv2.0的疾病相关分子集及其功能挖掘模块，根据慢性肾炎的临床表型合集，以临床表现的英文词条为检索词（表1），建立慢性肾炎相关基因集。
1.5蛋白间相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络信息
TCMIPv2.0平台整合了Reactome（
