柯萨奇病毒B1接种豚鼠建立药物性肌炎模型
柯萨奇病毒B1接种豚鼠建立药物性肌炎模型
中华神经科杂志 1999年第3期第32卷 论著
作者：吴文涛 侯熙德
单位：吴文涛 210002 南京军区南京总医院神经内科；侯熙德 南京医科大学第一附属医院神经内科
关键词： 药物性肌炎；柯萨奇病毒B组；豚鼠
【摘要】 目的 探讨柯萨奇病毒B1（CVB1）感染与药物性肌炎 (PM)发病的关系，利用 CVB1接种豚鼠建立PM模型。方法 分别用0.1 ml（ A组）和0.3 ml（ B组）毒力 （TCID50，即50% 细胞感染剂量）为10-5的CVB1分别一次性接种24只和36只豚鼠，并用3 mg（阈下剂量）兔肌匀浆加完全弗氏佐剂每周免疫1次；另有10只豚鼠，仅用3 mg兔肌匀浆加完全弗氏佐剂每周免疫1次为对照组（C组），共5周。结果 A、B组3周后均有豚鼠出现四肢肌无力等症状，肌酶谱明显升高，豚鼠股肌病理呈局灶性炎性改变，C组无异常。 A、B组5周后的肌酶谱升高阳性率存在显著差异（A组为11.8%，B组为38.2%)。结论 CVB1感染是PM发病诱因之一，其毒力及接种量与PM的发病相关。
Study on coxsackievirus B1-induced polymyositis in guinea pig models
WU Wentao*， HOU Xide. * Department of Neurology, General Hospital of Nanjing Command, PLA, Nanjing 210002
【Abstract】 Objective To study the relation between infection with coxackievirus B1(CVB1) and onset of polymysitis in the polymyositis models of guinea pigs infected with CVB1.Method Sixty guinea pigs were innoculated with 0.1 ml of CVB1 in group A and with 0.3 ml of CVB1 in group B. The CVB1 toxicity being 10-5 TCID50. Then they were immunized once a week with 3 mg rabbit muscle homogenates in Freund′s complete adjuvant, ten guinea pigs immunized once a week only with 3 mg rabbit muscle homogenates in Freund′s complete adjuvant as a control (group C).Results Some guinea pigs innoculated with CVB1 showed muscular weakness of their limbs, the serum enzymes were evidently elevated and the histopathological, muscular changes of polymyositis were confirmed 3 weeks after the viral infection, the guinea pigs of group C were normal. The positive rates of elevation in muscle enzymes were significantly different between the two groups of guinea pigs. In group A elevation in muscle enzymes was found in 11.8%, whereas in group B it appeared in 38.2% five weeks after the viral infection.Conclusion Not only infection with coxsackievirus B1 could induce PM but also its quantity and toxicity were correlated with the onset of polymyositis.
【Key words】 Polymyositis Coxsackieviruses B Guinea pigs
柯萨奇病毒B1（CVB1）接种诱发药物性肌炎 (PM)的小鼠模型，在国外已建立，国内尚未见报道。我们在柯萨奇病毒( CVB ) 诱发实验性PM的初步研究中，比较了毒力（TCID50，即50%细胞感染剂量）为10-5的CVB的血清型和感染量与致病性的关系，发现一定量的一定毒力的 CVB1 能诱发建立PM豚鼠模型。我们在本研究中增加了接种的豚鼠数量，重复CVB1感染试验，以进一步确定 CVB1感染与PM的相关性。
材料和方法
1.动物:70只短毛英国种豚鼠(南京医科大学动物中心提供 )，体重300～500 g。雌雄各半,随机分组。
2.肌匀浆的制备:取家兔股部肌肉，剔除神经、血管、筋膜等组织，加适量生理盐水，用刀式匀浆机10 000 r/min连续3次，30秒/次，粗纱布过滤后，经超声匀浆机匀浆肌细胞，每次10分钟，连续3次制成匀浆，涂片经MGG染色镜检，未见完整细胞及细胞核结构，置-20℃备用。此匀浆经考马斯亮蓝法测定蛋白含量为20 mg/ml。
3.病毒悬液:CVB1毒种来源于中国预防医学科学院病毒研究所，在南京医科大学微生物教研室用vero细胞传代，滴定TCID50为10-5，置-20℃备用。
4.病毒接种及肌匀浆免疫：CVB1悬液于第1周一次性腹腔注射，肌匀浆每周于颈部或背部皮下注射1次。 动物分3组。A组:豚鼠24只，每只CVB1悬液 0.10 ml，每只每次0.15 ml肌匀浆+0.15 ml弗氏佐剂（CFA）。 B组: 豚鼠36只，每只CVB1悬液0.30 ml，每只每次0.15 ml肌匀浆 +0.15 ml CFA。 C组：豚鼠10只，每只每次0.15 ml肌匀浆＋0.15 ml CFA。
5.肌酶谱检测:心脏穿刺取血，每次取血2 ml，于干净试管离心5分钟(3 000 r/min)，取血清0.5 ml，用Olympus-AU800生化自动分析仪检测。
6.病理检查:病毒接种后第3、5周，断颈或心脏注射空气栓子处死豚鼠，或取血死亡时立即取材，取双侧股肌及心、肝、肾、脑及周围神经组织，用体积分数为0.10的甲醛固定，石蜡包埋连续切片，HE染色镜检。
7.超微结构检查:取肌酶谱升高的豚鼠双侧股肌，用体积分数为0.05的戊二醛固定，超薄切片,常规电镜染色后观察。
结果
一、病毒接种后动物表现
接种后第3周A、B两组部分豚鼠出现倦怠、食欲下降、活动减少、双下肢肌无力;至第5 周生长缓慢、体重下降、四肢对称无力、行走缓慢摇摆。C组豚鼠未见异常症状。
二、肌酶谱
分别于病毒接种前及接种3、5周后检测A、B 两组肌酶谱。结果表明，病毒接种3、 5周后肌酶谱较接种前明显升高（表1），接种3周后与接种前的CPK、LDH和AST值经t检验，差异均有极显著意义(t=7.14、5.85、6.91，P＜0.001)，其中，肌酶谱以CPK升高幅度最大，最高达7 660 IU/L。但病毒接种5周后肌酶谱较3周后升高不明显，二者差异无显著意义。 C组单用3 mg兔肌匀浆免疫前与免疫3、5周后的肌酶谱比较，差异无显著意义。以+1.96s为正常肌酶谱的最高限，则CPK、LDH、AST的正常值最高限分别为857 IU/L、385 IU/L、101 IU/L。 A、B两组豚鼠肌酶谱升高阳性率见表2。由表2可知，A、B两组豚鼠病毒接种5周后与3 周后的肌酶谱升高阳性率基本无差异，但B组肌酶谱升高阳性率高于A组，以两组5 周后肌酶谱升高阳性率做χ2检验，差异有显著意义（χ2=3.85,P＜0.05)。
表1 病毒接种前后豚鼠肌酶谱(IU/L)
| 肌酶 | 接种前 | 3周后 | 5周后 |
| CPK |
392±238 |
2734±1308* |
3263±1697 |
| LDH | 200±94 | 383±124* | 313±117 |
| AST | 66±18 | 207±81* | 112±45 |
* 与病毒接种前相比，P＜0.001
表2 A、B两组豚鼠肌酶谱升高率的比较
| 分组 | 3周后△ | 5周后 |
| A组 | 14.3%(1/7) | 11.8%( 2/17) |
| B组 | 33.3%(3/9) | 38.2%(13/34)* |
*与A组相比，P＜0.05；△病毒接种3周后，为减少因心脏穿刺取血致豚鼠死亡， A组只随机检测了 7只豚鼠有效血清， B组只检测了9只
三、病理检查
肌酶谱升高的豚鼠股肌纤维呈多灶性炎性改变，以单核细胞和多形核细胞为主，直接侵犯肌纤维，病灶中可见肌纤维溶解及坏死 (图1～4)，未见肌纤维再生。病毒接种5周后与3 周后的肌纤维病理改变无明显差别。心、肝、肾、脑及周围神经组织未发现异常，病毒接种前及 C组的豚鼠肌病理检查也未见异常。
图1 肌纤维呈多灶性炎性改变，周围部分纤维变性 HE×100
图2 肌纤维及血管周围炎性病变，炎细胞以单核细胞和中性粒细胞为主 HE×400
图3 肌纤维灶性炎性病变及血管周围炎性病变 HE×100
图4 肌纤维炎性病变 HE×400
四、超微结构检查
光镜下呈病理阳性改变的股肌标本在电镜下观察，可见肌纤维间淋巴细胞直接浸润。肌纤维横纹、细胞核及线粒体未见异常。
讨论
PM病因和发病机制迄今不明，有研究认为与自身免疫异常有关［1］。诱因可能与感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病有关，其中病毒感染渐引起人们的重视。
用CVB1接种豚鼠建立PM模型在国内外尚未见报道。为此，我们在CVB诱发豚鼠药物性肌炎的初步研究中，初步确定了CVB病毒血清型的致病性、毒力和其接种量及肌匀浆的阈下剂量（单独用该剂量免疫不致病）［2］。我们增加了豚鼠数量，用相同毒力的CVB1接种重复试验。结果表明，CVB1接种建立PM豚鼠模型方法具有较好的可重复性。
我们建立的PM豚鼠模型，从症状、肌酶谱及病理改变均符合 Bohn提出的PM诊断标准［3］。实验结论如下: （1） CVB1 接种是 PM发病诱因之一。（2）病毒接种量、毒力与药物性肌炎发病相关。（3）病毒接种诱发的PM呈急性或亚急性起病。在实验中，多次用小剂量（3 mg）兔肌匀浆免疫豚鼠，目的在于增强病毒接种诱发的对骨骼肌的特异自身免疫损害，提高发病率和避免并发其他疾病，而单用该剂量兔肌匀浆免疫不致病，原因是抗原量不足，如预实验［2］和本实验C组的结果。用少于5 mg的兔肌匀浆注射豚鼠诱发肌炎，国内外未见报道。
单用CVB1接种诱发成功建立PM新生鼠模型，在国外已有报道［4，5］。我们在预实验中单用CVB1接种豚鼠，发病率极低，原因是豚鼠对肠道病毒不敏感，故本实验未设单纯CVB1组。单用CFA注射豚鼠不致病，已有研究报道［6］，本实验C组结果也能证明此点。
肌酶谱的升高多在病程的活动期，CPK、LDH、 AST广泛存在于肌细胞中，当肌纤维炎性病变时，肌细胞被破坏或肌细胞膜通透性增高，上述肌酶谱就被释放至血清中。本实验中，豚鼠肌酶谱在病毒接种后第3周已见升高，其中CPK最高已达7 660 IU/L，但至第5 周肌酶继续升高不明显，阳性率也未见上升，结合豚鼠症状，提示：（1）病毒接种诱发的肌炎主要呈急性或亚急性起病，与其他原因诱发的肌炎呈亚急性或慢性起病的特点不同［6］。（2）病毒接种诱发的肌炎可能存在自限性，有待进一步研究。不同量的病毒接种豚鼠组的肌酶谱升高阳性率均不高（本实验最高为 38.2%），且存在明显差异，结合有关研究结果，提示不仅病毒的毒株、毒力和接种量与PM发病有关，且与动物的种类、年龄和体重等相关［7］。豚鼠的肌酶谱升高幅度基本与症状和病理改变程度相符，其中以CPK升高幅度最大，特异性最高。
发病豚鼠的股肌病理检查结果以肌纤维中的炎细胞浸润灶为主，伴有局灶的肌纤维变性坏死，未见肌纤维再生。比较病毒接种后第3、 5周的病理改变，加重不明显。炎细胞以单核、多形核细胞为主，与其他研究一致［4］。推测可能是病变早期的非特异性免疫反应，单核、多形核细胞对病毒感染的肌纤维进行吞噬。是否诱发体液和细胞免疫取决于机体的免疫机能、病毒接种量和毒力等，病毒接种后肌炎可能存在的自限性是否也在于此，尚需深入研究。
本课题为江苏省教委自然科学基金资助(No.教95046)
参考文献
1 Targoff IN. Immune manifestations of inflammatory muscle disease. Rheumatic Disease Clinics of North America, 1994，20:857-875.
2 吴文涛，储旭华，侯熙德.柯萨奇病毒诱发实验性药物性肌炎的初步研究.卒中与神经疾病,1996,3:176-178.
3 Bohan A，Peter JB. Polymyositis and dermatomyositis. N Engl J Med, 1975,292:403-407.
4 Ray CG，Minnich LL， Johnson PC. Selective polymyositis induced by coxsackievirus B1 in mice. J Infect Dis,1979,140:239-243.
5 Ytterberg SR，Mahowald ML， Messner RP. Coxackievirus B1-induced polymyositis. J Clin Invest,1987,80:499-506.
6 侯熙德，蔡昭，沈鸣九,等.药物性肌炎动物模型的研究.中国实验免疫学杂志,1993,5:3-7.
7 Hays AP，Gamboa ET. Acute viral myositis. In: Engel AG, Banker BQ, eds. Myology. NewYork: Mackrow-hill,1986.1456-1457.
(收稿：1998-08-11 修回：1998-11-06)
